Της Μαριτίνας Λάππα,
Η τεχνική CRISPR-Cas9, συνιστά μια επαναστατική μέθοδο γενετικής τροποποίησης που χρησιμοποιείται για τη στοχευμένη επεξεργασία γονιδιωμάτων. Ο τρόπος λειτουργίας της στηρίζεται σε ένα μηχανισμό που συναντάμε στα βακτήρια, ο οποίος σχετίζεται με την προστασία τους από τους ιούς. Ο ιός μπορεί να εισαχθεί στο βακτηριακό κύτταρο και να το σκοτώσει, καθώς απελευθερώνει μέσα σε αυτό το DNA του, επιδιώκοντας τον πολλαπλασιασμό του. Ωστόσο, το βακτήριο μπορεί να καταπολεμήσει τον ξένο εισβολέα, καθώς διαθέτει ένα ανάλογο σύστημα άμυνας και ανοσοποίησης.
Τι είναι το CRISPR;
Το “CRISPR” (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) αναφέρεται ουσιαστικά σε ένα συγκεκριμένο τμήμα του βακτηριακού γονιδιώματος που αποτελείται από καθορισμένες αλληλουχίες με ορισμένα χαρακτηριστικά. Η γενετική αυτή μονάδα, εντοπίστηκε για πρώτη φορά, στο βακτήριο E. coli. Οι ερευνητές, εντόπισαν μικρά τμήματα DNA που επαναλαμβάνονται πάνω στο «βακτηριακό χρωμόσωμα» και αποτελούνται από παλίνδρομες αλληλουχίες, δηλαδή από αλληλουχίες που «διαβάζονται» το ίδιο και προς την αριστερή και προς τη δεξιά κατεύθυνση, στο δίκλωνο DNA. Ανάμεσα σε αυτές τις επαναλαμβανόμενες παλίνδρομες αλληλουχίες, υπάρχει το διαχωριστικό DNA, τα τμήματα του οποίου δεν είναι πανομοιότυπα μεταξύ τους, αλλά κάθε κομμάτι είναι διαφορετικό.
Ο πολυμορφισμός του διαχωριστικού DNA προβλημάτισε και μπέρδεψε τους επιστήμονες. Όμως, μετά από εξειδικευμένη μελέτη, διαπιστώθηκε ότι το διαχωριστικό DNA περιλαμβάνει αλληλουχίες όμοιες με ιικό DNA. Έτσι, διεξήχθη το συμπέρασμα ότι τα βακτήρια αποθηκεύουν στο γονιδίωμά τους θραύσματα DNA ιών που τα έχουν προσβάλει. Με τον τρόπο αυτό, το βακτηριακό κύτταρο καταγράφει τις επιθέσεις που δέχεται από διαφορετικά στελέχη ιών, γεγονός που του επιτρέπει να τα αναγνωρίζει και να τα καταστρέφει σε ενδεχόμενη επόμενη προσβολή. Αργότερα, εντοπίστηκαν μερικά γονίδια που σχετίζονται με τη λειτουργία του τμήματος CRISPR και ονομάζονται γονίδια Cas. Τα γονίδια αυτά, κωδικοποιούν πρωτεΐνες, οι οποίες διαθέτουν δράση ελικάσης ή νουκλεάσης και συνήθως συνδυάζονται, λειτουργώντας σαν σύμπλοκα.
Όταν, λοιπόν, ένας ιός συχνά βακτηριοφάγος προσβάλει το βακτήριο και απελευθερώσει το DNA του μέσα σε αυτό, ξεκινά η έκφραση των γονιδίων Cas και η παραγωγή των πρωτεϊνών, ενώ ταυτόχρονα ξεκινά και η μεταγραφή της συστοιχίας CRISPR. Από αυτήν θα προκύψει ένα μόριο RNA, το οποίο θα περιέχει αλληλουχίες συμπληρωματικές προς το DNA του ιού. Το μόριο RNA, δεσμεύεται σε πρωτεΐνες Cas, και έτσι δημιουργείται το σύμπλοκο του ανοσοποιητικού συστήματος των βακτηρίων. Με το RNA, καθίσταται δυνατή η εύρεση του ιικού dna-στόχου και με τα ένζυμα Cas επιτυγχάνεται η καταστροφή του ξένου γενετικού υλικού και, άρα, η εξολόθρευση του εισβολέα.
Πώς λειτουργεί η τεχνική CRISPR–Cas9;
Οι επιστήμονες, αφού διαλεύκαναν και κατανόησαν αυτόν τον μηχανισμό των βακτηρίων, θεώρησαν ότι με τις ανάλογες προσαρμογές θα μπορούσε να λειτουργήσει αποτελεσματικά σαν μέθοδος στοχευμένης επεξεργασίας γενετικού υλικού ζωντανών κυττάρων. Στην πραγματικότητα, η αναπτυσσόμενη τεχνική CRISPR-Cas9 στηρίζεται σε σχετικά απλές διεργασίες και αξιοποιεί μικρό αριθμό μορίων. Συνοπτικά, ακολουθεί τα τρία αυτά βήματα: αναγνώριση – διάσπαση – επιδιόρθωση.
Το πρώτο βήμα είναι ο προσδιορισμός της αλληλουχίας DNA που πρόκειται να υποστεί επεξεργασία. Ακολουθεί η κατασκευή ενός μορίου RNA-οδηγού, που θα εντοπίζει την επιθυμητή αλληλουχία ανάμεσα σε όλο το γονιδίωμα, με βάση τους κανόνες συμπληρωματικότητας των βάσεων. Το μόριο RNA προσδένεται στο ένζυμο Cas9 και το δημιουργούμενο σύμπλοκο είναι ικανό να «ψάχνει» το γονιδίωμα, ώστε να βρει το επιθυμητό τμήμα DNA. Ύστερα από κάποιες αλληλεπιδράσεις με περιοχές-στόχους, το RNA-οδηγός θα εντοπίσει την αλληλουχία που έχουμε ορίσει και το ένζυμο θα κόψει την δίκλωνη έλικα του DNA σε συγκεκριμένα σημεία.
Σειρά έχει η επιδιόρθωση. Το κύτταρο μπορεί να επιλέξει ανάμεσα σε δύο πιθανά μονοπάτια. Το πρώτο περιλαμβάνει ειδική ενζυματική διαδικασία, η οποία στοχεύει στη σύνδεση των άκρων της διπλής έλικας, στο σημείο όπου έγινε η εγκοπή από το ένζυμο Cas9. Πρόκειται για το κυρίαρχο μηχανισμό επιδιόρθωσης, ο οποίος συχνά μπορεί να οδηγήσει σε λάθη και δημιουργία επιπλέον μεταλλάξεων. Η εναλλακτική επιλογή, είναι πιο ακριβής και απαιτεί χρήση εξωγενούς DNA. Ουσιαστικά, στόχος είναι το επιθυμητό γονιδιακό τμήμα να τοποθετηθεί στο σημείο όπου επέδρασε το ένζυμο.
Ύστερα από αυτή τη διαδικασία, το γενετικό υλικό του κυττάρου έχει τροποποιηθεί. Τα αποτελέσματα μπορεί να είναι ποικίλα και να επιφέρουν ενεργοποίηση ή καταστολή κάποιου γονιδίου, ή απλώς επιδιόρθωση στην αλληλουχία ενός γονιδίου, με σκοπό την παραγωγή σωστού γονιδιακού προϊόντος.
Βασικές εφαρμογές
Αναμφίβολα, μέθοδοι σαν κι αυτή, που δίνουν τη δυνατότητα στους επιστήμονες να επεξεργαστούν με μεγάλη ακρίβεια το γενετικό υλικό ζωντανών κυττάρων, καθίστανται ιδιαίτερα χρήσιμες στην εξέλιξη των επιστημονικών πεδίων και γι’ αυτό έχουν πολυάριθμες εφαρμογές.
- Στην ιατρική, η εν λόγω τεχνική επεξεργασίας γονιδιώματος, βρίσκει άμεση εφαρμογή στη θεραπεία γενετικών ασθενειών. Οι επιστήμονες με τον τρόπο που αναλύθηκε παραπάνω, μπορούν και επιδρούν στα γονίδια που ευθύνονται για ορισμένα γενετικά νοσήματα, είτε καταστέλλοντας την λειτουργία τους, είτε διορθώνοντας την μεταλλαγμένη αλληλουχία τους. Προκύπτει, έτσι, ένα εξαιρετικά σύγχρονο θεραπευτικό μοντέλο το οποίο εφόσον εξασφαλίσει εγγυημένη αποτελεσματικότητα γλιτώνει τον ασθενή από επιβαρυντικές επιπτώσεις άλλων θεραπευτικών μεθόδων, που θα απαιτούσαν ισχυρή και επαναλαμβανόμενη φαρμακευτική αγωγή.
- Εξίσου σημαντική είναι η συμβολή της τεχνικής αυτής και στον τομέα της έρευνας. Καθώς οι επιστήμονες προσπαθούν να εξακριβώσουν το μηχανισμό λειτουργίας πολλών γονιδίων και άλλων τμημάτων γενετικού υλικού, χρειάζονται ένα εργαλείο με το οποίο θα μπορούν εύκολα να «πειράζουν» το DNA. Οι αλλαγές που θα προκαλέσουν σε αυτό, θα οδηγήσουν σε ανάλογα αποτελέσματα από τα οποία οι ερευνητές θα διεξάγουν τα αντίστοιχα συμπεράσματα για το ρόλο της εκάστοτε γενετικής αλληλουχίας.
- Στη γεωργία, μέθοδοι σαν κι αυτή επιτρέπουν την αξιοποίηση τεχνικών βιοτεχνολογίας. Η τεχνική CRISPR-Cas9 μπορεί κάλλιστα να αξιοποιηθεί και για την επεξεργασία γενετικού υλικού φυτικών αλλά και ζωικών κυττάρων. Έτσι, καθίσταται δυνατή η δημιουργία γενετικά τροποποιημένων φυτών και ζώων, που θα παρουσιάζουν ορισμένες επιθυμητές ιδιότητες, όπως για παράδειγμα φυτά με ανθεκτικότητα στις χαμηλές θερμοκρασίες, γεγονός που μπορεί να συμβάλλει στην ενίσχυση της αγροτικής οικονομίας.
Ποιος να το φανταζόταν, ότι ένας μηχανισμός άμυνας των βακτηρίων απέναντι στους ιούς, θα αποτελούσε την βάση για την ανάπτυξη μιας άκρως καινοτόμου μεθόδου επεξεργασίας γονιδιωμάτων. Η CRISPR-Cas9 έχει ανοίξει τον δρόμο για την ανάπτυξη νέων εφαρμογών σε γενετικό επίπεδο, καθώς παρέχει μεγάλη ακρίβεια, ταχύτητα και απαιτεί περιορισμένες οικονομικές δαπάνες. Μάλιστα, το 2020 οι ερευνήτριες Emmanuelle Charpentier και Jennifer Doudna έλαβαν το Νόμπελ χημείας για την ανάπτυξη αυτού του «γενετικού ψαλιδιού». Κι ενώ η αξιοποίηση της CRISPR-Cas9 υπόσχεται σημαντικές εξελίξεις σε πολλούς επιστημονικούς τομείς, δεν παύει να συνοδεύεται από ερωτήματα ηθικής φύσης. Η ανάγκη για σαφή όρια και υπεύθυνη χρήση της τεχνολογίας αυτής είναι ένα ζήτημα που αναπόφευκτα θα μας απασχολήσει στο μέλλον.
ΕΝΔΕΙΚΤΙΚΗ ΠΗΓΗ
- Mechanism and applications of CRISPR/Cas-9-mediated genome editing. Biologics: Targets & Therapy, DovePress, διαθέσιμο εδώ
